Как клетки осуществляют отбор и перенос веществ между органеллами

Ольга Шомрон (Тель-Авивский университет)

Клетки: животные клетки, из таких клеток состоим мы.
Вещества:белки (протеины) и липиды (жиры).
Органеллы: внутриклеточные функциональные отсеки, заключенные в мембрану, Перенос, перемещение: Везикулярный транспорт, а именно: перемещение носителей (пузырьков) по микротрубочкам.

Почему процессы сортировки и перемещения белков и жиров внутри клетки важны?
Без транспорта белков на внешнюю оболочку клетки, на мембрану, не попадет ни один рецептор, ни один ионный канал регулирующий концентрации ионов по разные стороны мембраны, не будет выпущен из клетки ни один гормон, ни один сигнал не выйдет и не попадет в клетку. Не будет никакого взаимодействия с внешней средой. Любая клетка взаимодействует с внешней средой, будь она самостоятельным организмом или клеткой многоклеточного организма, даже питательные вещества в нее попадают через белки-транспортеры. То есть без внутриклеточного транспорта клетка станет нежизнеспособной. Именно поэтому практически нет болезней, связанных с мутациями в белках транспорта – механизм настолько важен, что практически любое нарушение в системе будет летальным.

У клетки есть много органелл (сопоставимых с органами в многоклеточном организме). У каждой органеллы своя внутренняя среда, кислотность, состав и функция. В органелле называющейся эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР) синтезируются и обрабатываются все белки и липиды, предназначенные на выход, то есть те белки и жиры, которые функционируют на клеточной мембране (например рецепторы) или за пределами клетки (например гормоны или другие сигнальные молекулы, выпускаемые клеткой) или в другие органеллы внутри клетки. Свое перемещение такие белки начинают с Участков Экспорта, определенных структурах органеллы ЭПР. В этих участках происходит подготовка к перемещению, а именно сортировка, проверка качества и концентрация в пузырьках – носителях.
Структуры Участков Экспорта идентифицируются и определяются присутствием белкового комплекса COPII. (Белковый комплекс - это несколько белков, связанных между собой нековалентно, функционирующих вместе).

Окаймляющий белковый комплекс COPII необходим для процесса транспортировки. Он взаимодействует с белками, предназначенными для перемещения, и отбирает правильно свернутые белки предназначенные для перемещения или секреции из клетки. Из всех разнообразных белков комплекса оболочки, единственный белок, который напрямую взаимодействует с перемещаемыми белками это белок Sec24.

Процесс формирования окаймления COPII начинается с взаимодействия белка, который должен быть перемещен на мембрану, с белками внутренней оболочки, которые, в свою очередь, взаимодействуют с белками внешней оболочки. В конце процесса окаймленная везикула отщепляется, после чего сразу же белковое окаймление COPII распадается на отдельные белки и носитель (везикула), уже без оболочки, продолжает свой путь по микротрубочкам.

Молекулярные модели окаймления, полученные компьютерными симуляциями, на основе физически разрешенных позиций и углов взаимодействия отдельных белков в общую составленную оболочку, имеют сферическую форму.

При этом, структуры COPII, полученные экспериментально в пробирке из очищенных белков COPII- цилиндрические, трубчатые.

Чтобы наблюдать за комплексом COPII внутри клетки под микроскопом, мы можем пометить (покрасить) только одну из его частей. Мы, конечно, не можем различить каждую светящуюся молекулу, мы только видим скопления белков, их распределение по клетке. В большинстве наших экспериментов мы используем для этого Sec24, один из белков комплекса СОРII, именно этот белок взаимодействует напрямую с перемещаемыми белками.

Так как мы изучаем систему транспорта клетки и ее функционирование, нам необходим также светящийся перемещаемый белок, чтобы следить за его передвижением по клетке. Мы используем для этого белок VSVG с флуоресцирующим хвостом. Этот белок является рабочей лошадкой, которую мы гоняем по системе.
Он имеет все необходимые свойства для идеального перемещаемого белка – он светится, он нетоксичен, и очень быстро и эффективно проходит клеточный транспорт на внешнюю мембрану. Кроме этого, VSVG обладает еще одним важным свойством– чувствительностью к температуре.

В белке VSVG есть небольшая мутация, которая никак не мешает этому белку в обычных условиях, то есть в 32-37°С. Но если немного поднять температуру, до 39°С, для клетки это будет небольшой стресс, но вполне терпимый, а этот белок уже не может свернуться правильно и поэтому не проходит проверку качества и застревает в ЭПР ровно до тех пор пока температура не опускается до 37°C и белок тут же сворачивается как следует, и почти моментально транспортируется из ЭПР. Таким образом, мы можем синхронизировать процесс секреции и следить за динамикой выхода белка из ЭПР будет намного проще.

В эксперименте опубликованном еще в 2000 году английской лабораторией под руководством профессора Стивенса, клетки продуцируют (синтезируют) два светящихся белка. Красный белок – оболочка, зеленый – перемещаемый белок VSVG.
В их эксперименте мы наблюдаем процесс накопления перемещаемых белков в транспортные пузырьки на участках экспорта и последующее отщепление пузырьков и их движение дальше. Мы видим, что красная оболочка отделена от зеленого VSVG с самого начала процесса накопления, задолго до отделения пузырька.
Это пространственное разделение оболочки и VSVG, когда белок оболочки и перемещаемые белки находятся рядом, вплотную, но без полного наложения, невозможно объяснить в рамках классической модели, в которой принято, что оболочка окаймляет зарождающийся пузырек-носитель.

Это наблюдение, так же, как многие другие результаты позволили нам усомниться в справедливости классической модели и заставили искать альтернативные объяснения наблюдаемым результатам.

Mы предлагаем другую модель. В нашей модели цилиндрическая оболочка COPII находится на границе между ЭПР и Участком Экспорта, где оболочка выполняет функцию контроля качества и отбора перемещаемых белков. Вместо окаймления носителя, в новой модели COPII окаймляет трубочку (ножку) на конце которой и формируется везикула – пузырек носитель.
COPII окаймление действует как конвейер, который приводится к действию тремя основными движущими силами:
1. Асимметричное добавление белков к оболочке COPII (только со стороны ЭПР).Добавление белков оболочки только с одной стороны приводит к общему движению от ЭР к участку экспорта.
2. Динамичное слабое взаимодействие белков оболочки с перемещаемыми белками. Во время активации и сборки оболочки, комплекс COPII слабо взаимодействует с перемещаемыми белками, движет их к участку экспорта, и таким образом концентрирует их на зарождающейся везикуле. Почему взаимодействие слабое? Чтобы не только прицепить белки к оболочке, но и отпустить их в будущий носитель.
3. Третья сила опирается на тот факт, что мембраны ЭПР и клеточная мембрана не одинаковые. Они отличаются не только своим составом, но и толщиной. Мембрана ЭПР - самая тонкая и текучая из всех мембран. Клеточная мембрана - самая жесткая и толстая. Поэтому белки, которые функционируют на клеточной мембране, имеют длинную гидрофобную часть, точно подходящую под толщину клеточной мембраны. В тонкой мембране ЭПР такие белки находятся в энергетически невыгодном состоянии и стремятся найти более комфортное место. Толщина мембраны Участков Экспорта - промежуточная между мембраной ЭПР и клеточной мембраной. На границе между ЭПР и Участком Экспорта толщина мембраны меняется плавно, и белки с длинными гидрофобными частями стремятся туда, где мембрана более толстая, то есть, в Участок Экспорта.

Теперь сравним свойства и проявления новой модели с каноном.

Каноническая модель не может объяснить пространственное несоответствие оболочки и белков. С другой стороны, наша модель легко его объясняет, поскольку в ней оболочка сидит на границе ЭПР и Участка Экспорта и нагнетает поток переносимых белков и мембраны в зарождающуюся везикулу.

В канонической модели размер везикулы определяется (или задается) размером жесткой сферической оболочки COPII, и считается равным 50-70 нанометрам. Однако, в наших экспериментах мы видим носители разного размера и формы, от 300 нанометров (видимых как точки) до нескольких тысяч нанометров (видимых как змейки). Наша модель позволяет носителю быть произвольного размера, который будет зависеть от количества перемещаемых белков и скорости их накопления.

Участки экспорта это постоянные, устойчивые структуры. В классической модели, в учебниках, на картинках демонстрирующих формирование транспортного пузырька нету упоминания участков экспорта, поскольку на мембране нет никаких специфических мест для образования везикул, тогда как в новой модели окаймленная ножка формирует такую специфическую структуру.

Более того, окаймление COPII остается на месте после того как носитель покидает участок экспорта и перемешается по микротрубочке к своей цели.В классической модели оболочка СОРII распадается моментально после отщепления носителя, поэтому по этой модели мы ожидали бы увидеть мерцание красных точек – появилось-пропало. Снова появилось и снова пропало, но этого не происходит.В новой модели отщеплению носителя не сопутствует распад структуры трубочки, везикула отщепляется не нарушая структуру Участков Экспорта и отсортированные мембраны с белками могут отщепляться не мешая непрерывному процессу сортировки и аккумуляции переносимых белков.

В классической модели количества белков оболочки и белков груза находятся в прямой пропорции. По нашим наблюдениям определенной пропорции нету.
Все Участки Экспорта демонстрируют разные пропорции. Более того, белки накапливаются и уходят без особых изменений в количестве оболочковых белков.

Цель моего исследования была обосновать новую модель, либо опровергнуть ее. Этой цели трудно достичь, поскольку процесс сортировки, накапливания, и переноса очень динамичен, и трудно различить его стадии. Поэтому было бы желательно расцепить ранние и поздние стадии этого процесса. В нашей лаборатории была создана система, в которой происходит качественная сортировка и накопление, но перенос заблокирован. Поэтому обработка клеток комбинацией двух ядов (Brefeldin A/Nocodazole), которые блокируют транспорт, приводит к раздуванию участков экспорта.
Переносимые белки накапливается в гигантских Участках Экспорта, которые достигнув критического размера, коллапсируют обратно в ЭПР. Гигантские Участки Экспорта не формируют везикулы, они нестабильны (сливаются друг с другом и коллапсируют в ЭПР), при этом они правильно сортируют и накапливают грузовые белки и обеспечивают приток мембраны в Участки Экспорта. Скорость накопления одинаков в обработанных и необработанных клетках. То есть яды не нарушают процесс сортировки.

Наблюдая за обработанными ядами BrefeldinA/Nocodazole клетки с гигантскими участками экспорта, мы отчетливо видим, что пространственное разделение белков оболочки и грузового белка VSVG еще более явное, чем в необработанных клетках.

Когда мы начинаем прослеживать динамику этих набухших участков экспорта, мы видим, что флуоресцентный сигнал оболочки остается практически постоянным. У этого постоянства есть два аспекта. Во-первых, подобно тому, что мы видели в необработанных клетках, пропорция белков оболочки и переносимых белков не сохраняется. То есть, мы видим накопление переносимого белка, при котором количество оболочки не меняется. Во-вторых, мы видим резкое падение сигнала перемещаемого белка во время коллапса пузыря, тогда как сигнал оболочки практически не меняется.

Недавно ученые научились преодолевать предел оптического разрешения, который считался непреодолимым по законам физики, раза в два-три. (За это получили Нобелевскую премию). На трехмерной реконструкции Участков Экспорта, полученную на таком супермикроскопе, мы видим удлиненную структуру COPII, a не просто светящуюся точку.

Кроме этого, есть способ математической обработки сигнала (так называемая деконволюция), который тоже позволяет увеличить разрешение. Получив изображение клетки на таком микроскопе, и здесь мы видим структуру сферы и ножки, помеченной COPII.

Далее, мы спланировали и создали мутированный белок оболочки. Компьютерная модель этого белка предсказывает более закрытую структуру вокруг перемещаемого белка и усиленное взаимодействие с переносимым белком. При взаимодействии с мутированной оболочкой переносимый белок имеет меньше степеней свободы, тогда как нормальные белки даже в связанном виде имеют возможность относительного движения.
В клетке с нормальной оболочкой COPII перемещяемый белок VSVG накапливается в Участках Экспорта. В клетке с мутированной оболочкой перемещаемые белки застревают в ЭПР и не попадают даже в участки экспорта. Если бы была справедлива классическая модель, то мы бы ожидали еще более эффективного накопления груза в Участках Экспорта, но этого не происходит, система блокирует белок на более раннем этапе, на входе в Участок Экспорта.

Итак, мы сравнили две модели транспорта: классическую и новую, предложенную нами. Мы провели ряд экспериментов. Ни один из наших результатов не может быть объяснен старой моделью, но все они прекрасно согласуются с новой.